美国乔治亚大学 Y. George Zheng 教授在STTT上发表文章:采用停止流动荧光检测方式开发PRMT1抑制剂

日期:2018-03-15    作者: STTT编辑部     来源:Sigtrans       分享:

美国乔治亚大学Y. George Zheng教授在自然出版社与川大华西医院生物治疗国家重点实验室联合主办的 《Signal Transduction and Targeted Therapy》(STTT)上发表了研究性文章,采用停止流动荧光检测方式开发PRMT1抑制剂,采用这种方法不仅能用该筛选PRMT1的小分子抑制剂,同时还能确认该小分子抑制剂的作用机制。(http://www.nature. com/articles/sigtrans20175,阅读原文及下载PDF可直接点击本文最下方“阅读原文”)。该文的通讯作者是Y. George Zheng教授,第一作者是Kun Qian博士。


蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMTs)是真核生物中至关重要的表观遗传调节因子,可作为染色质重塑的组蛋白编写者(writer)。 PRMTs还能甲基化多种非组蛋白底物以调节其功能和活性。越来越多的证明表明甲基转移酶蛋白在多种生物学过程和疾病中发挥着至关重要的作用。研究发现,PRMT1负责细胞内大多数(85%以上)的I型甲基转移。PRMT1催化H4R3 (H4R3me2a)的不对称的甲基转移,从而影响基因的转录激活(图1 A)。除此之外,PRMT1还参与RNA剪接、DNA修复和信号转导。PRMT1已与人类端粒有关,并能直接参与Akt信号传导通路,同时,大量的非组蛋白底物也是PRMT1的底物,如DNA修复蛋白MRE11,p53结合蛋白1(53BP1),CSNK1a1激酶,HIF-1等。鉴于PRMT1在体内的重要作用,它的异常表达与多种疾病有关。PRMT1与心血管疾病和炎症反应一定的关系,如糖尿病和高血压。在乳腺癌,前列腺癌,肺癌,结肠癌,膀胱癌和白血病等癌症中可以观察到PRMT1的过表达或是异常剪接。PRMT1是目前药物开发领域的热点,然而遗憾的是,目前并没有太多有效的PRMT1小分子抑制剂。

同时,目前已经报道的多数PRMT1的抑制剂都缺乏明确的作用机制信息。从 PRMTs的晶体结构中可以发现, PRMTs有两个相邻的结合位点,共作用因子SAM结合位点和底物结合位点,对于共作用因子SAM结合位点,所有的PRMTs的SAM结合位点都非常相似; 对于底物结合位点,所有的PRMTs在底物结合位点都拥有一条非常保守的Double-E loop,精氨酸残基可以与Double-E loop上的两个非常重要的谷氨酸残基和两个谷氨酸中间的蛋氨酸/亮氨酸的骨架形成氢键相互作用。这样的高度保守性使得找到选择性作用于某一特定的PRMTs蛋白的抑制剂非常困难,特别是I型PRMTs的选择性抑制剂。因此PRMTs的小分子抑制剂可分为共同作用因子竞争性抑制剂、底物竞争性抑制剂和同时作用于两个位点的混合型抑制剂。


为开发更好的PRMT1小分子抑制剂,美国乔治亚大学Y. George Zheng教授团队为PRMT1抑制剂开发和作用基质的研究建立了一种基于流动荧光的停止检测方法。首先,使用荧光肽H4FL研究PRMT1介导的精氨酸甲基化,并建立 相关的动力学模型(如图1B)。



为了验证该模型的正确性,Y. George Zheng教授团队分别采用了共同作用因子竞争性抑制剂SAH(图2)和西奈芬近(sinefungin)、底物竞争性抑制剂H4R3me2a(图3)对该模型进行了验证,验证结果表明,放假模型能很好的区分两种类型的抑制剂并能准确测量出抑制剂的IC50。

随后,为了进一步验证该方法的有效性,Y. George Zheng教授团队还验证了有名的PRMT1抑制剂DB75 (furamidine)(图4)以及最近发现的MS023(参考文献1)。对DB75的检测确认了DB75是底物竞争性抑制剂,且测得的IC50也与之前报道的数值相近。




对MS023检测的结果则比较特殊,该结果(图5)与底物竞争性抑制剂(例如DB75和H4R3me2a)或共作用因子竞争性抑制剂(例如SAH和sinefungin)的结果不同。MS023可能是一种混合型非竞争性抑制剂,部分具有底物竞争性。 事实上,先前有报道显示MS023的既不与共作用因子竞争SAM竞争,也不与底物竞争;而根据与MS023与PRMT6的X射线共晶体结构,MS023抑制剂占据了底物精氨酸 结合位点。


综上所述,该方法是目前PRMT1抑制剂检测方法具有同质,非放射性和混合测量的优点,可以连续测量甲基化反应及其抑制活性。该方法不仅能够定量确定PRMT1抑制剂的效力(IC50),还能够确认抑制剂的作用机制,区分辅因子竞争性抑制剂,底物竞争性抑制剂和混合型抑制剂。



参考文献

(1) Kaniskan, H. ü. et al. A potent, selective and cell-active allosteric inhibitor of protein arginine methyltransferase 3 (PRMT3). Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54, 5166–5170 (2015).

(2)Hu, H., Qian, K., Ho, M. C. & Zheng, Y. G. Small molecule inhibitors of protein arginine methyltransferases. Expert Opin. Invest Drugs 25, 335–358 (2016).

(3)Qian, K. & Zheng, Y. G. Current development of protein arginine methyltransferase inhibitors. In: J. Medina-Franco (ed). EPI-Informatics: Discovery and Development of Small Molecule Epigenetic Drugs and Probes 231–256. (Elsevier, Amsterdam, 2016).

(4)Li, K. K., Luo, C., Wang, D., Jiang, H. & Zheng, Y. G. Chemical and biochemical approaches in the study of histone methylation and demethylation. Med. Res. Rev. 32, 815–867 (2012).

(5)Wu, J., Xie, N., Feng, Y. & Zheng, Y. G. Scintillation proximity assay of arginine methylation. J. Biomol. Screen. 17, 237–244 (2012).

(6)Hu, H., Luo, C. & Zheng, Y. G. Transient kinetics define a complete kinetic model for protein arginine methyltransferase 1. J. Biol. Chem. 291, 26722–26738 (2016).

(7)Feng, Y., Xie, N., Wu, J., Yang, C. & Zheng, Y. G. Inhibitory study of protein arginine methyltransferase 1 using a fluorescent approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 567–572 (2009).

(8)Wu, J. & Zheng, Y. G. Fluorescent reporters of the histone acetyltransferase. Anal. Biochem. 380, 106–110 (2008).

Y. George Zheng教授目前就职于美国乔治亚大学,郑教授的实验室致力于化学、生物学和医学的最前沿领域。目前活跃的研究领域包括:(1)开发有效和选择性的表观遗传小分子抑制剂,(2)设计用于研究蛋白质乙酰化和新型赖氨酸酰化的化学探针,以及(3)蛋白质精氨酸甲基化的机理和功能研究。目前已经发表SCI论文70余篇。

个人主页: http://pbs.rx.uga.edu/people/faculty-members/ yujun-george-zheng/

Signal Transduction and Targeted Therapy简介


《Signal Transduction and Targeted Therapy》(STTT)是自然出版集团和四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室合作出版的全英文生物医学专业期刊(网站:http://www.nature. com/sigtrans,点击本网站最下方"阅读原文”)。主编由美国俄亥俄州立大学Carlo M. Croce教授(美国三院院士,Cancer Research前主编),UCSD的张康教授、川大华西医院魏于全教授/院士担任。有来自全球等多个国家及地区的多位相关领域的近百位著名学者组成编委会。本杂志每周五发表文章,欢迎各位投稿,包括论著或综述。对于原创性成果采取“快速通道”模式,帮助作者以最快的速度发表文章,最快一周可接收。该杂志发表论文可免收发表费。该杂志投稿格式不限,正式发表之前再按杂志格式修改。感谢将此信息转发给您们的同事、朋友以及学生等。

Cite this articleKun Qian, Hao Hu, Hui Xu & Y George Zheng. Detection of PRMT1 inhibitors with stopped flow fluorescence. Signal Transduction and Targeted Therapy. volume 3, Article number: 6 (2018) doi:10.1038/ s41392-018-0009-6.